在實(shí)驗室和海洋中構建用于測量浮游植物生物量、生理學(xué)和光合作用的高級熒光系統
1. 研究目的和內容
研究目的
該項目的目的是建造一種小型的臺式儀器，稱(chēng)為F熒光I誘導和R馳預（mini-FIRe）系統，用于離散樣品分析和連續測量浮游植物在海洋中的豐度和生理狀況。與Rutgers團隊發(fā)明和開(kāi)發(fā)的前代FRRF和FIRe熒光儀不同，新儀器將表現出增強的靈敏度（約10倍），可實(shí)時(shí)提供更多生理參數。新儀器的高靈敏度使得它們對于在公海的實(shí)地工作有巨大價(jià)值。
研究?jì)热?/span>
使用可變熒光技術(shù)對浮游植物和其他光合作用生物的光合作用活性的評估 - 光合作用生物的生理狀態(tài)的快速和無(wú)損評估依賴(lài)于使用快速重復率熒光學(xué) （FRRF） 及其技術(shù)后續熒光感應和放松 （FIRE） 技術(shù)。這項技術(shù)是由Rutgers團隊發(fā)明和開(kāi)發(fā)的。評估光合作用生物生存能力的基本方法依賴(lài)于葉綠素"可變熒光"剖面的測量和分析，葉綠素是光合作用機構*的特性（Falkowski等人于2005年對此進(jìn)行了審查）。"可變熒光"技術(shù)依賴(lài)于葉綠素熒光與光合作用過(guò)程效率之間的關(guān)系，并提供了一套全面的熒光和光合作用參數的有機體。光學(xué)測量是靈敏的，快速的，無(wú)損的，可以實(shí)時(shí)和原位完成。
這種方法和已實(shí)現的儀器學(xué)原理是在同行評審文獻中確立的（Falkowski and Kolber 1995; Kolber at al., 1998; Gorbunov et al., 2000, 2001; Gorbunov and Falkowski 2004）。最初是為研究水柱中的浮游植物而開(kāi)發(fā)的，FRR技術(shù)提供了準確的信息，說(shuō)明浮游植物群落的運作以及控制海洋初級生產(chǎn)力的環(huán)境因素的影響（e.g., Falkowski and Kolber 1995; Falkowski and Raven 2007; Behrenfeld et al., 1996; Coale et al, 2004; Falkowski et al, 2004）。使用臺式和潛水式FRR和FIRe熒光儀成為美國和世界上大多數生物海洋學(xué)項目不可分割的一部分。
已開(kāi)發(fā)出F熒光I誘導和R馳預（FIRe）技術(shù) ，以測量光合作用生物的一套全面的光合作用和生理特征（Gorbunov and Falkowski 2005）。 FIRe 技術(shù)基于對由一系列激發(fā)閃光引起的熒光瞬態(tài)的記錄和分析，這些閃光的強度、持續時(shí)間和間隔精確控制（圖 1 和 Gorbunov and Falkowski 2005）。 該技術(shù)提供了一套全面的參數，這些參數的特點(diǎn)是光合作用采光過(guò)程、光系統 II （PSII） 中的光化學(xué)以及光合作用電子傳輸到碳固定。由于這些過(guò)程對環(huán)境因素特別敏感，FIRe 技術(shù)為識別和診斷自然（營(yíng)養限制、光化學(xué)和光刺激、熱應力等）和人為應激因素（如污染）提供了基礎。
圖1。FIRe 熒光瞬時(shí)的例子。熒光產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)記錄為微秒時(shí)間分辨率，包括四個(gè)階段：（一階段，100 ms）100 ms的強短脈沖（稱(chēng)為單周轉閃光，STF）適用于累積飽和PSII，并測量從Fo到Fm（STF）的熒光感應：（第二階段，500ms）弱調制光用于記錄500ms時(shí)間尺度上熒光產(chǎn)量的放松動(dòng)能：（第三階段，50 ms）50ms 持續時(shí)間的強長(cháng)脈沖（稱(chēng)為多周轉閃光，MTF）用于飽和 PSII 和 PQ 庫：（第 4 階段，1 s） 弱調制光用于記錄 PQ 庫在 1s 的時(shí)間尺度內再氧化的動(dòng)力學(xué)。 第 1 階段的分析提供：最小和至大熒光產(chǎn)量（Fo，Fm）；PSII光化學(xué)電荷分離的量子效率Fv/Fm（STF）；PSII 的功能橫截面，σPSII; 和連接因子（p）。第 2 階段為 PSII 接收方的電子傳輸提供時(shí)間常數（即Qa 受體側再氧化）。第 3 階段提供 Fm（MTF）和 Fv/Fm（MTF）。第 4 階段揭示了 PSII 和 PSI 之間的電子傳輸時(shí)間常數（PQ 庫的再氧化）。
可變熒光技術(shù)的生物物理背景- 在室溫下，葉綠素熒光主要產(chǎn)生于PSII。當PSII反應中心處于開(kāi)放狀態(tài)（Qa氧化）時(shí)，熒光產(chǎn)量極小，Fo。當 Qa 還原（例如，通過(guò)暴露在強光下）時(shí)，反應中心關(guān)閉，熒光產(chǎn)量增加到其高水平 Fm。為了檢測Fo和Fm，FIRe技術(shù)記錄了由強烈的飽和脈沖光（~100 μs，稱(chēng)為單周轉閃光，STF）引起的熒光感應（圖1第1階段）。熒光感應率與PSII的功能吸收橫截面成正比，而熒光上升的相對幅度Fv/Fm則由PSII光化學(xué)的量子效率來(lái)定義。熒光感應的形狀由單個(gè)光合作用單元之間的激發(fā)量轉移控制，并由"連接因子"（Kolber et al. 1998）定義。因此，在沒(méi)有能量轉移（p = 0）的情況下，熒光感應呈指數級，當p 增加到 ~0.5 到 0.7 的至大值時(shí)，就會(huì )變成反曲線(xiàn)。
PSII 受體側電子傳輸的動(dòng)能（即Qa再氧化）是通過(guò) STF 之后的熒光馳預動(dòng)力學(xué)分析（圖 1 第 2 階段）評估的。熒光動(dòng)力學(xué)由幾個(gè)部分組成，因為Qa再氧化的速度取決于第二個(gè)電子受體Q b的狀態(tài)，Qb作為移動(dòng)雙電子受體工作：
Qa- Qb → Qa Qb- (150 - 200 ms) (1)
Qa- Qb- → Qa Qb= (600 - 800 ms) (2)
Qa- _ → Qa- Qb → Qa Qb- (~ 2000 ms) (3)
反應 （3） 與 Qb 最初脫離 D1 蛋白結合位點(diǎn)時(shí)的條件相對應。此外，一小部分電子傳輸受損的失活反應中心可能有助于馳預動(dòng)力學(xué)中最慢的組件。FIRe 軟件使用 3 組件分析處理馳預動(dòng)力學(xué)，以檢索電子傳輸的時(shí)間常數（即 Q 氧化 tQa）。
PSII 和 PSI 之間的電子傳輸的時(shí)間常數 tPSII-PSI 是從多周轉閃光（MTF，圖 1 中的第 3 階段和第 4 階段）之后的熒光馳預動(dòng)力學(xué)分析中檢索到的。 在大多數生理條件下，這個(gè)時(shí)間常數是由質(zhì)體醌（PQ）庫再氧化的速度決定的，并且是一個(gè)數量級比tQa慢一個(gè)數量級。
測量一系列環(huán)境光強的FIRe熒光參數，可以重建光合作用電子傳輸的速率，Pf，作為光強的函數（光合作用與光強曲線(xiàn)）（Kolber and Falkowski, 1993）。Pf 與光照產(chǎn)物和環(huán)境光下測量的光化學(xué)量子產(chǎn)量成正比（DF'/Fm'）。分析這些光合作用與光強曲線(xiàn)提供了光合作用至大電子傳遞速率（Pmax）和光飽和系數（Ek）。光合作用與輻射測量使用 FIRe 的光化光源 （ALS） 進(jìn)行，該光源通過(guò) FIRe 數據采集軟件由計算機控制。
研發(fā)背景和專(zhuān)業(yè)知識 – Rutgers團隊的成員在可變熒光技術(shù)和方法的研發(fā)方面積累了超過(guò) 20 年的經(jīng)驗。他們發(fā)明并開(kāi)發(fā)了10多項生物物理研究的*儀器（參見(jiàn)相關(guān)同行評審出版物的附錄參考清單）。
2. 儀器介紹
mini-FIRe基于與之前臺式FIRe儀器相同的生物物理原理（Gorbunov and Falkowski 2005），但新儀器更緊湊3倍，靈敏度提高10倍。葉綠素濃度的下限低至 ~0.005 mg/m3，這使得mini- FIRe對于在公海進(jìn)行現場(chǎng)采樣非常有價(jià)值。
在這里，Rutgers團隊提議建造一個(gè)mini-FIRe（圖2）該儀器將用于離散樣品分析（例如，從站點(diǎn)的尼斯金瓶收集的樣品）和/或在海洋中持續進(jìn)行取樣。儀器將配備一個(gè)流經(jīng)的樣品室，用于連續繪制浮游植物生物量和光合作用特性。以下是mini-FIRe記錄的生理參數列表和儀器技術(shù)規格mini-FIRe（圖2）。該儀器將用于離散樣品分析（例如，從站點(diǎn)的尼斯金瓶收集的樣品）和/或在海洋中持續進(jìn)行取樣。該儀器將配備一個(gè)流經(jīng)的樣品室，用于連續繪制浮游植物生物量和光合作用特性。以下是mini-FIRe記錄的生理參數列表和儀器技術(shù)規格。
圖2 mini-FIRe熒光儀，具有增強的靈敏度。
測量參數：
●暗適應后最小和至大熒光產(chǎn)量（Fo， Fm）
●光適應下有效、最小和至大熒光產(chǎn)量（F'， Fo'， Fm'） *
●光系統II、PSII 中光化學(xué)至大有效量子產(chǎn)量（Fv/Fm 和DF'/F m））
●三波長(cháng)下功能性PSII吸收截面積（sPSII）
●光合作用單元之間的能量轉移效率（"連接因子"）
●PSII 受體側電子傳遞時(shí)間常數（Q a 到Qb，Qa 到 Qb-）
●PSII 和 PSI 之間的光合作用電子傳輸時(shí)間常數
●電子傳遞速率，ETR，作為光強的函數 *
●光化學(xué)淬火系數 （qP）和非光化學(xué)淬火系數 （NPQ） *
●至大光合速率、初始斜率和光合作用周轉時(shí)間（從 F 與 E 曲線(xiàn)得到）
●這些參數是使用光化光源 （ALS） 測量，并記錄為光強曲線(xiàn)。
mini-FIRe 系統的技術(shù)規格：
●靈敏度：0.005 - 100 mg/m3葉綠素a（可通過(guò)添加中性密度減壓過(guò)濾器提高采樣濃度）
●激發(fā)光源：藍色（峰值波長(cháng)450 nm，30 nm帶寬），綠色（峰值波長(cháng)530 nm，40 nm帶寬），橙色（峰值波長(cháng)590 nm，30 nm帶寬），用于選擇性激發(fā)不同功能組的浮游植物。
●發(fā)射檢測：680 nm（葉綠素a）和880 nm（細菌葉綠素a），其他波長(cháng)可使用可更換的發(fā)射濾光片進(jìn)行選擇。
●尺寸： 10 x 5 x 12 英寸
