FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統

FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統

FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統是目前功能強大全面的植物顯微熒光研究?jì)x器，是基于FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)的顯微成像定制系統。它由包含可擴展部件的增強顯微鏡、高分辨率CCD相機、激發(fā)光源組、光譜儀、控溫模塊以及相應的控制單元和專(zhuān)用的工作站與分析軟件組成。它不僅可以進(jìn)行微藻、單個(gè)細胞、單個(gè)葉綠體乃至基粒-基質(zhì)類(lèi)囊體片段進(jìn)行Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應曲線(xiàn)、QA再氧化等各種葉綠素熒光及MCF多光譜熒光（multicolor fluorescence）成像分析；還能通過(guò)激發(fā)光源組進(jìn)行進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測量，從而進(jìn)行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料以及藻青蛋白、藻紅蛋白、藻膽素等藻類(lèi)*熒光色素的成像分析；更可以利用光譜儀對各種熒光進(jìn)行光譜分析，區分各發(fā)色團（例如PSI和PSII及各種捕光色素復合體等）并進(jìn)行深入分析。

FKM多光譜熒光動(dòng)態(tài)顯微成像系統使熒光成像技術(shù)真正成為光合作用機理研究的探針，使科研工作者在藻類(lèi)和高等植物細胞與亞細胞層次深入理解光合作用過(guò)程及該過(guò)程中發(fā)生的各種變化，為直接研究葉綠體中光合系統的工作機理提供了有力的工具。FKM作為藻類(lèi)/植物表型和基因型顯微研究的雙重利器，得到了學(xué)界的廣泛認可并取得了大量的科研成果。

功能特點(diǎn)

?內置現今葉綠素熒光研究的全部程序，如Fv/Fm、Kautsky誘導效應、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應曲線(xiàn)、QA再氧化等，可獲得70余項參數。

?配備10倍、20倍、40倍、63倍和100倍專(zhuān)用生物熒光物鏡，可以清晰觀(guān)測到葉綠體及其發(fā)出的熒光。

?激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光、藍光、綠光、白光、紫外光和遠紅光等，通過(guò)紅藍綠三色光還可以調出可見(jiàn)光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類(lèi)中任何一種色素分子或發(fā)色團。

?可進(jìn)行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析

?高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖。

?控溫系統可以保證實(shí)驗樣品在同等溫度條件下進(jìn)行測量，提高實(shí)驗精度，也可以進(jìn)行高溫/低溫脅迫研究。

應用領(lǐng)域

? 微藻、大型藻類(lèi)/高等植物的單個(gè)細胞、單個(gè)葉綠體、基粒-基質(zhì)類(lèi)囊體片段等的顯微結構植物光合生理研究

? 藻類(lèi)/植物逆境研究

? 生物和非生物脅迫的研究

? 藻類(lèi)/植物抗脅迫能力及易感性研究

? 突變體篩選及光合機理研究

? 藻類(lèi)長(cháng)勢與產(chǎn)量評估

? 藻類(lèi)*色素與光合作用關(guān)系

? 藻類(lèi)/植物——微生物交互作用研究

? 藻類(lèi)/植物——原生動(dòng)物交互作用研究

? 基因工程與分子生物學(xué)研究

測量樣品

? 植物活體切片

? 植物表皮

? 植物細胞

? 綠藻、藍藻等各種單細胞和多細胞微藻

? 葉綠體提取液

? 類(lèi)囊體提取液

? 含有葉綠體的原生動(dòng)物

工作原理

FKM分析過(guò)程中，通過(guò)連接在顯微鏡上的激發(fā)光源組和內置在6位濾波輪中的一系列濾波器、分光鏡激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團的動(dòng)態(tài)熒光。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進(jìn)行熒光光譜分析和熒光動(dòng)力學(xué)成像分析。SM 9000光譜儀通過(guò)光纖與顯微鏡連接，以進(jìn)行激發(fā)熒光光譜分析。安裝在顯微鏡頂部的高分辨率CCD相機則用于熒光動(dòng)力學(xué)成像分析。全部工作過(guò)程通過(guò)工作站和控制單元按照預先設定好的程序自動(dòng)進(jìn)行。測量過(guò)程中，可通過(guò)溫控模塊調控藻類(lèi)、植物細胞等實(shí)驗樣品的溫度。蠕動(dòng)泵可以實(shí)現培養藻類(lèi)的連續測量。

儀器組成

1. 增強顯微鏡

2. 高分辨率CCD相機

3. 激發(fā)光源組

4. SM 9000光譜儀

5. 主控制單元

6. 工作站及軟件

7. 控溫模塊的控制單元

8. 6位濾波輪

技術(shù)參數

? 測量參數

?Fo, Fo’, Fs, Fm, Fm’, Fp, FtDn, FtLn, Fv, Fv'/ Fm', Fv/ Fm ,Fv',Ft,ΦPSII, NPQ_Dn, NPQ_Ln, Qp_Dn, Qp_Ln, qN, qP，QY, QY_Ln, Rfd, ETR等50多個(gè)葉綠素熒光參數，每個(gè)參數均可顯示2維熒光彩色圖像

?OJIP快速熒光曲線(xiàn)：測定分析OJIP曲線(xiàn)與二十幾項相關(guān)參數包括：Fo、Fj、Fi、P或Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss 、N（QA還原周轉數量）、Phi???_Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC（單位反應中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（單位反應中心初始捕獲光量子通量）、ETo/RC（單位反應中心初始電子傳遞光量子通量）、DIo/RC（單位反應中心能量散失）、ABS/CS（單位樣品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo、RC/CSx（反應中心密度）、PIABS（基于吸收光量子通量的“性能"指數或稱(chēng)生存指數）、PIcs（基于截面的“性能"指數或稱(chēng)生存指數）等（選配）

?GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白和熒光染料的成像分析（選配）

?QA再氧化動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)（選配）

?Spectrum熒光光譜圖（選配）

?具備完備的自動(dòng)測量程序（protocol），可自由對自動(dòng)測量程序進(jìn)行編輯

?Fv/Fm：測量參數包括Fo，Fm，Fv，QY等

?Kautsky誘導效應：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等熒光參數

?熒光淬滅分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY，ΦII，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多個(gè)參數，2套制式程序

?光響應曲線(xiàn)LC：Fo，Fm，QY，QY_Ln，ETR等熒光參數

?Dyes & FPs穩態(tài)熒光成像測量

?OJIP快速熒光動(dòng)力學(xué)分析：Mo（OJIP曲線(xiàn)初始斜率）、OJIP固定面積、Sm（對關(guān)閉所有光反應中心所需能量的量度）、QY、PI等26個(gè)參數（選配）

?QA再氧化動(dòng)力學(xué)（選配）

?Spectrum熒光光譜分析（選配）

?熒光激發(fā)光源：紅外光、紅光、橙光、藍光、綠光、白光、紫外光等可選，根據客戶(hù)要求定制光源組

?透射光源（選配）：白光、遠紅光

?高分辨率TOMI-2 CCD傳感器：

?逐行掃描CCD

?圖像分辨率：1360×1024像素

?時(shí)間分辨率：在圖像分辨率下可達每秒20幀

?A/D 轉換分辨率：16位（65536灰度色階）

?像元尺寸：6.45µm×6.45µm

?運行模式：1）動(dòng)態(tài)視頻模式，用于葉綠素熒光參數測量；2）快照模式，用于GFP等熒光蛋白和熒光染料測量

?通訊模式：千兆以太網(wǎng)

?顯微鏡：Axio Imager M2，可選配Axio Scope A1簡(jiǎn)潔版或Axio Imager Z2高級版

?物鏡轉盤(pán)：研究級7孔自動(dòng)物鏡轉盤(pán)

?透射光快門(mén)

?聚光器 Achr Apl 0.9 H

?6位反光鏡轉盤(pán)

?雙目鏡筒(100:0/30:70/0:100)

?機械載物臺：75×50mm，硬膜陽(yáng)極氧化表面

?樣品架：76×26mm

?物鏡：10倍、20倍、40倍、63倍和100倍專(zhuān)用生物熒光物鏡（可選）

?6位濾波輪：葉綠素熒光、GFP/SYTOX、DAPI/CTC等

?SM9000光譜儀

?入射狹縫：70µm×1400µm

?光柵：平場(chǎng)型校正

?光譜范圍：200-980nm

?波長(cháng)精確度：<0.5nm

?再現性：<0.1nm

?溫度漂移：<0.01nm/K

?溫度調控模塊：溫度調節范圍 5℃-70℃，精確度0.1℃

?蠕動(dòng)泵（選配）：流速10-5600µl/min，用于藻類(lèi)連續培養測量

?FluorCam葉綠素熒光成像分析軟件功能：具Live（實(shí)況測試）、Protocols（實(shí)驗程序選擇定制）、Pre–processing（成像預處理）、Result（成像分析結果）等功能菜單

?客戶(hù)定制實(shí)驗程序協(xié)議（protocols）：可設定時(shí)間（如測量光持續時(shí)間、光化學(xué)光持續時(shí)間、測量時(shí)間等）、光強（如不同光質(zhì)光化學(xué)光強度、飽和光閃強度、調制測量光等），具備專(zhuān)用實(shí)驗程序語(yǔ)言和腳本，用戶(hù)也可利用Protocol菜單中的向導程序模版自由創(chuàng )建新的實(shí)驗程序

?自動(dòng)測量分析功能：可設置一個(gè)實(shí)驗程序（Protocol）自動(dòng)無(wú)人值守循環(huán)成像測量，重復次數及間隔時(shí)間客戶(hù)自定義，成像測量數據自動(dòng)按時(shí)間日期存入計算機（帶時(shí)間戳）

?快照（snapshot）模式：通過(guò)快照成像模式，可以自由調節光強、快門(mén)時(shí)間及靈敏度得到清晰突出的植物樣本穩態(tài)熒光和瞬時(shí)熒光圖片

?成像預處理：程序軟件可自動(dòng)識別多個(gè)植物樣品或多個(gè)區域，也可手動(dòng)選擇區域（Region of interest，ROI）。手動(dòng)選區的形狀可以是方形、圓形、任意多邊形或扇形。軟件可自動(dòng)測量分析每個(gè)樣品和選定區域的熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)及相應參數，樣品或區域數量不受限制（>1000）

?數據分析模式：具備“信號計算再平均"模式（算數平均值）和“信號平均再計算"模式，在高信噪比的情況下選用“信號計算再平均"模式，在低信噪比的情況下選擇“信號平均再計算"模式以過(guò)濾掉噪音帶來(lái)的誤差

?輸出結果：高時(shí)間解析度熒光動(dòng)態(tài)圖、熒光動(dòng)態(tài)變化視頻、熒光參數Excel文件、直方圖、不同參數成像圖、不同ROI的熒光參數列表等

葉綠素熒光與光譜分析結果

典型應用：

產(chǎn)地：捷克

參考文獻：

1.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381

2.Konert G, et al. 2019. Protein arrangement factor: a new photosynthetic parameter characterizing the organization of thylakoid membrane proteins. Physiologia Plantarum 166: 264-277.

3.Exposito-Rodriguez M, et al. 2017. Photosynthesis-dependent H2O2 transfer from chloroplasts to nuclei provides a high-light signalling mechanism. Nature Communications, 8: 49

4.Higo S, et al. 2017. Application of a pulse-amplitude-modulation (PAM) fluorometer reveals its usefulness and robustness in the prediction of Karenia mikimotoi blooms: A case study in Sasebo Bay, Nagasaki, Japan. Harmful Algae, 61:63-70

5.Jacobs M, et al. 2016. Photonic multilayer structure of Begonia chloroplasts enhances photosynthetic efficiency. Nature Plants, doi:10.1038/nplants.2016.162

6.Andresen E, et al. 2016. Cadmium toxicity investigated at the physiological and biophysical levels under environmentally relevant conditions using the aquatic model plant Ceratophyllum demersum. New Phytol., 210(4):1244-1258

7.Thomas G, et al. 2016. Deficiency and toxicity of nanomolar copper in low irradiance—A physiological and metalloproteomic study in the aquatic plant Ceratophyllum demersum. Aquatic Toxicology, 177:226-236

8.Fujise L, et al. 2014. Moderate Thermal Stress Causes Active and Immediate Expulsion of Photosynthetically Damaged Zooxanthellae (Symbiodinium) from Corals. PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0114321

9.Gorecka M, et al. 2014. Abscisic acid signalling determines susceptibility of bundle sheath cells to photoinhibition in high light-exposed Arabidopsis leaves. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 369(1640), DOI: 10.1098/rstb.2013.0234

10.Mishra S, et al. 2014. A different sequence of events than previously reported leads to arsenic-induced damage in Ceratophyllum demersum L. Metallomics, 6: 444-454

11.Ferimazova N, et al. 2013. Regulation of photosynthesis during heterocyst differentiation in Anabaena sp. strain PCC 7120 investigated in vivo at single-cell level by chlorophyll fluorescence kinetic microscopy. Photosynthesis Research, 116(1): 79-91

12.Andresen E, et al. 2013. Effects of Cd & Ni toxicity to Ceratophyllum demersum under environmentally relevant conditions in soft & hard water including a German lake. Aquatic Toxicology. 142–143, 15: 387–402