通常所測樣品溶液濃度下限可達10^-6~10^-5mol/L，適用于測定食品中的微量組分（如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等）。

一、原理

1.1 物質(zhì)對光的選擇性吸收
當光束照射到物質(zhì)上時(shí)，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。
1.1.1 溶液顏色的產(chǎn)生
當一束白光通過(guò)某一有色溶液時(shí)，一些波長(cháng)的光被溶液吸收，另一些波長(cháng)的光則透過(guò)溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。人把自身能感覺(jué)到的光定義為可見(jiàn)光。在可見(jiàn)光區，不同波長(cháng)的光呈現不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長(cháng)所決定。透射光與吸收光可組成白光，故稱(chēng)這兩種光互為補色光，兩種顏色互為補色。

1.1.2 光吸收的本質(zhì)
當一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時(shí)，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量就轉移到分子、原子或離子上，是這些粒子由**能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能態(tài)（激發(fā)態(tài)），這個(gè)作用稱(chēng)為物質(zhì)對光的吸收。
被激發(fā)的粒子約在10^-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續的量子化能級，僅當照射光光子的能量h_υ，與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當時(shí)，才能發(fā)生吸收。不同物質(zhì)微粒由于結構不同而具有不同的量子化能級，其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。所以物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。

1.1.3 吸收曲線(xiàn)
吸收曲線(xiàn)，也稱(chēng)為吸收光譜，描述了物質(zhì)對不同波長(cháng)的光的吸收能力。將不同波長(cháng)的光透過(guò)某一固定濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長(cháng)下有色溶液對光的吸收程度（即吸光度），然后以波長(cháng)為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，繪制的曲線(xiàn)即為吸收曲線(xiàn)。
不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近的吸光度隨著(zhù)濃度增加而增大，但**吸收波長(cháng)不變。若在**吸收波長(cháng)處測定吸光度，則靈敏度***高。因此，吸收曲線(xiàn)是分光光度法中選擇測定波長(cháng)的重要依據。

1.2 光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律：
當一束平行單色光通過(guò)液層厚度為b的有色溶液時(shí)，溶質(zhì)吸收了光能，光的強度就要減弱。溶液的濃度越大，通過(guò)的液層厚度越大，入射光越強，則光被吸收的越多，光強度的減弱也越顯著(zhù)。該定律是紫外可見(jiàn)分光光度法等各類(lèi)吸光光度法定量分析的依據，是由實(shí)驗觀(guān)察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。
A=lg(I/I₀)=εbc
A-吸光度；
I₀-入射光強度，cd；
I-透射光強度，cd；
ε-吸光系數，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長(cháng)度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：當一束平行單色光通過(guò)單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長(cháng)和溶劑的情況下的一個(gè)特征常數，數值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。由實(shí)驗結果計算ε時(shí)，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實(shí)際上時(shí)表觀(guān)摩爾吸光系數。在多組分體系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒(méi)有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。
透光度T是透射光強度I與入射光強度I₀之比，即：
T=I/I₀
因此：A=lg(1/T)

二、主要部件
盡管光度計種類(lèi)型號繁多，但它們都是由相同的基本部件組成的，包括光源、單色器、吸收池和檢測系統。

2.1 光源
在測量吸光度時(shí)，要求光源發(fā)出所需波長(cháng)范圍內的連續光譜，要具有足夠的光強度，并在一定時(shí)間內能保持穩定。
在可見(jiàn)光區測量時(shí)，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態(tài)時(shí)會(huì )發(fā)出波長(cháng)在320~2500nm之間的連續光譜。鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K，熔點(diǎn)為3680K。鎢絲燈的溫度決定于電源電壓，電源電壓的微小波動(dòng)會(huì )引起鎢燈光強度的很大變化，因此必須使用穩壓電源。
在紫外區測量時(shí)，常采用氫燈或氘燈產(chǎn)生波長(cháng)在180~375nm之間的連續光譜作為光源。其理想光源應具有覆蓋整個(gè)紫外可見(jiàn)光區的連續輻射，強度應比較高，且隨波長(cháng)變化能量變化不大，但在實(shí)際上難以實(shí)現。氘燈輻射強度比氫燈高2~3倍，壽命也比較長(cháng)。氙燈的強度一般高于氫燈，但欠穩定，波長(cháng)范圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發(fā)光源。

2.2 單色器
單色器是將光源發(fā)射的復合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成：入光狹縫、準光氣（一般由透鏡或凹面反光鏡使入射光成為平行光束）、色散器、投影器（一般由一個(gè)透鏡或凹面鏡將分光后的單色光投影至出光狹縫）、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英制成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波長(cháng)的分析測定，在紫外區必須用石英棱鏡。
光柵的特點(diǎn)是：色散均勻，呈線(xiàn)性，光度測量便于自動(dòng)化，工作波段廣。

2.3 吸收池
也稱(chēng)為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個(gè)互相平行、透光且具有**厚度的平面。
玻璃吸收池光程長(cháng)度一般為1cm，也有0.1-10cm的。
由于吸收池厚度存在一定誤差，其材質(zhì)對光不是透明，在做定量分析時(shí)，對吸收池應做配套性試驗，試驗后標記出放置方向。
紫外光區數值不跳為石英。

2.4 檢測系統
檢測系統包括檢測器和記錄顯示裝置。
檢測器是一種光電轉換設備，將光強度轉變?yōu)殡娦盘?/strong>顯示出來(lái)。
常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大，不用放大，用于初級的分光光度計上，疲勞效應嚴重。
光電倍增管利用二次電子發(fā)射來(lái)放大光電流，放大倍數可高達10⁸倍，應用***為廣泛。
光二極管陣列檢測器由于全部波長(cháng)同時(shí)被檢測，掃描速度快，可在0.1s內完成對190-800nm波長(cháng)范圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結果顯示裝置。70年代采用數字讀出裝置。現代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控制儀器操作和處理測量數據，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。

三、測量條件的選擇
3.1 顯色反應及顯色條件的選擇
進(jìn)行比色分析或光度分析時(shí)，首先要把待測組分轉變成有色化合物，然后進(jìn)行比色或光度測定。
將待測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應，與待測組分形成有色化合物的試劑稱(chēng)為顯色劑。

3.1.1 顯色反應的選擇
顯色反應分兩類(lèi)，即絡(luò )合反應和氧化還原反應，絡(luò )合反應是***主要的顯色反應。
選用的原則是：
3.1.1.1 選擇靈敏的顯色反應。摩爾吸光系數ε的大小是顯色反應靈敏度高低的重要標志，因此應當選擇生成的有色物質(zhì)的ε較大的顯色反應。一般來(lái)說(shuō)，當ε為10⁴-10⁵時(shí)，可認為該反應靈敏度較高。
3.1.1.2 盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個(gè)組分或少數幾個(gè)組分發(fā)生顯色反應。
3.1.1.3 顯色劑在測定波長(cháng)處無(wú)明顯吸收。通常把兩種有色物質(zhì)**吸收波長(cháng)之差稱(chēng)為對比度，一般要求顯色劑與有色化合物的對比度在60nm以上。
3.1.1.4 反應生成的有色化合物組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩定。

3.1.2 顯色條件的選擇
吸光光度法測定的是顯色反應達到平衡后溶液的吸光度，因此要得到準確的結果，必須從研究平衡著(zhù)手，了解影響顯色反應的因素，控制適當的條件，使顯色反應和穩定。
3.1.2.1 根據溶液平衡原理，有色絡(luò )合物的穩定常數越大，顯色劑過(guò)量越多，越有利于待測組分形成有色絡(luò )合物。但是過(guò)量顯色劑的加入有時(shí)會(huì )引起副反應，對測定反而不利。
3.1.2.2 酸度對顯色反應的影響是多方面的。一種金屬離子與某種顯色劑反應的適宜酸度范圍是通過(guò)實(shí)驗來(lái)確定的。確定的方法是固定待測組分及顯色劑的濃度，改變溶液pH值，測定其吸光度，作出吸光度-pH值關(guān)系曲線(xiàn)，選擇曲線(xiàn)平坦部分對應的pH值作為測定條件。
3.1.2.3 顯色反應一般在室溫下進(jìn)行，有的反應需要加熱，以加速顯色反應，使之進(jìn)行。
3.1.2.4 大多數顯色反應需要經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能完成，其長(cháng)短與溫度的高低有關(guān)，也會(huì )受到空氣的氧化或發(fā)生光化學(xué)反應使眼色顏色減弱。因此必須通過(guò)實(shí)驗作出在一定溫度下的吸光度-時(shí)間關(guān)系曲線(xiàn)，得到適宜的顯色時(shí)間。

3.1.3 干擾的消除
3.1.3.1 干擾的類(lèi)型
光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將干擾測定。
a.干擾離子本身有顏色
b.干擾離子本身無(wú)顏色，但能與顯色劑反應生成穩定的配合物。若生成的配合物有色則直接干擾測定，若生成的配合物無(wú)色，也降低了顯色劑的濃度，影響被測離子與顯色劑的反應，而產(chǎn)生誤差。
c.干擾離子與被測離子反應生成配合物或沉淀，影響被測離子的測定。
3.1.3.2 消除干擾的方法
a.控制溶液酸度。
b.加入掩蔽劑與干擾離子形成更穩定的化合物，使干擾離子不再產(chǎn)生干擾。
c.里用參比溶液消除某些有色干擾離子的影響。
d.選擇適當的工作波長(cháng)以消除干擾。
e.采用適當的分離方法。

3.2 吸光度測量條件的選擇

3.2.1 入射光波長(cháng)的選擇
應根據吸收光譜曲線(xiàn)，選擇溶液具有**吸收時(shí)的波長(cháng)作為入射光的波長(cháng)。如顯色劑與鈷絡(luò )合物在420nm波長(cháng)處均有**吸收峰。如用此波長(cháng)測定鈷，則未反應的顯色劑會(huì )造成干擾而降低測定的準確度。因此必須選擇在500nm波長(cháng)處測定，在此波長(cháng)下顯色劑不發(fā)生吸收。而鈷絡(luò )合物則有一吸收平臺。

3.2.2 參比溶液的選擇
3.2.2.1 如果僅待測物與顯色劑的反應產(chǎn)物有吸收，可用純溶劑作參比溶液。
3.2.2.2 如果顯色劑或其他試劑略有吸收，應用空白溶液（不加試樣的溶液）作參比溶液。
3.2.2.3 如試樣中其他組分有吸收，但不與顯色劑反應，則當顯色劑無(wú)吸收時(shí)，可用試樣溶液作參比溶液，當顯色劑略有吸收時(shí)，可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，以此溶液作參比溶液。

3.2.3 吸光度讀數范圍的選擇
實(shí)踐證明，吸光度在0.2-0.5內時(shí)，測量的相對誤差***小。
可用兩種方法來(lái)調整被測溶液的吸光度：
3.2.3.1 控制被測溶液的濃度。如改變取樣量，改變溶液的濃縮倍數或稀釋倍數。
3.2.3.2 選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長(cháng)的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。

四、應用

4.1 應用領(lǐng)域

4.1.1高含量組分測定-示差法
當待測組分含量較高時(shí)，測得的吸光度值常常偏離朗伯-比爾定律。即使不發(fā)生偏離，也因為通常采用純溶劑作參比溶液（普通光度法），使測得的吸光度太高，超出適宜的讀數范圍而引入較大的誤差。采用示差法就能克服這一缺點(diǎn)。但應用示差法時(shí)，要求儀器光源有足夠的發(fā)射強度或能增大光電流放大倍數，以便能調節參比溶液透光度為99%。
這就要求儀器單色器質(zhì)量高，電光學(xué)系統穩定性好。

4.1.2 多組分分析
應用紫外可見(jiàn)分光光度法，常?？赡茉谕辉嚇尤芤褐胁贿M(jìn)行分離而測定一個(gè)以上組分。假定溶液中同時(shí)存在兩種組分x和y，其吸收光譜一般有重疊和不重疊兩種情況。不重疊的測定組分相互不產(chǎn)生干擾。若吸收光譜重疊，在波長(cháng)為λ₁和λ₂時(shí)分別測定吸光度A₁和A₂，由吸光度值的加和性得到聯(lián)立方程，通過(guò)解聯(lián)立方程求得各濃度值。

4.2 定量方法
紫外可見(jiàn)分光光度分析的定量依據是光吸收定律，但具體操作方法卻有多種

4.2.1 標準曲線(xiàn)法
即工作曲線(xiàn)法，適用于大量重復的樣品分析，是工廠(chǎng)控制分析中應用***多的方法。
根據光吸收定律，對于一種有色化合物，ε是一個(gè)定值，若把光程L也固定，那么吸光度A就和溶液的濃度c成正比，也就是說(shuō)吸光度A和濃度c呈線(xiàn)性關(guān)系。配制一系列適當濃度的標準溶液，顯色后分別測定其吸光度，把吸光度A對濃度c作圖，即得工作曲線(xiàn)。

4.2.2 直接比較法

直接比較法其實(shí)質(zhì)也是工作曲線(xiàn)法，是一種簡(jiǎn)化的工作曲線(xiàn)法。配一個(gè)已知被測組分濃度為cs的標樣，測其吸光度為As，在同樣條件下再測未知樣品的吸光度為Ax，通過(guò)計算可求出未知樣品的濃度cx。
A_s=εc_sL
A_x=εc_xL
由于溶液性質(zhì)相同，比色皿厚度一樣，所以A_s/A_x=c_s/c_x
式中：
c_s-已知被測組分的濃度，mol/L；
c_x-未知樣品的濃度，mol/L；
A_s-已知被測組分的吸光度；
A_x-未知樣品的吸光度。
直接比較法簡(jiǎn)化了繪制工作曲線(xiàn)的步驟，適用于個(gè)別樣品的測定。
操作時(shí)應注意配制標樣的濃度要接近被測樣品的濃度，這樣能減少測量誤差。

4.2.3 標準加入法
標準加入法是工作曲線(xiàn)的一種特殊應用。選擇適當的顯色條件，先測定濃度為cx的未知樣品吸光度為Ax，再向未知樣品中加入一定量的標樣，配置成濃度為cx+Δc1、cx+Δc2……一系列樣品，分別顯色后再測定吸光度為A1、A2……***后在坐標紙上繪圖，以吸光度A為縱坐標，以濃度c為橫坐標，分別畫(huà)出Δc1、Δc2所對應的A1、A2等各點(diǎn)，連成直線(xiàn)后延長(cháng)，與橫軸的交點(diǎn)cx也就是未知樣品的濃度cs。
應用標準加入法時(shí)要注意，加入的標樣濃度要適當，使畫(huà)出的曲線(xiàn)保持適當角度，濃度過(guò)大或過(guò)小都會(huì )帶來(lái)測量誤差。這種方法操作比較麻煩，不適于作系列樣品分析，但它適用于組成比較復雜，干擾因素較多而又不太清楚的樣品，因為它能消除背景的影響。

4.3 紫外可見(jiàn)分光光度計使用中的注意點(diǎn)
4.3.1 保護光源
光源燈有一定的壽命，儀器不工作時(shí)不要開(kāi)燈，若工作間歇時(shí)間短，可不關(guān)燈。
一旦停機，則要待燈冷卻后再重新啟動(dòng)，并預熱15min。
燈泡發(fā)黑或亮度明顯減弱或不穩定時(shí)，就及時(shí)更換。
經(jīng)經(jīng)紫外光照射后形成結痕可用無(wú)水乙醇去除。

4.3.2 保證合適的工作環(huán)境
溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。
不適宜的溫度和濕度可引起機械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降。造成光柵、反射鏡、聚焦鏡等光學(xué)部件的鋁膜銹蝕，產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等。甚至使儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護保養時(shí)應定期加以校正溫度和濕度。實(shí)驗室，特別是地處南方地區的實(shí)驗室，應具備四季恒溫的儀器室，配備恒溫設備。環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體也可以影響機械系統的靈活性、降低各種限位開(kāi)關(guān)、按鍵、光電耦合器的可靠性，也是造成光學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環(huán)境和儀器內衛生條件，防塵。

4.3.3 定期除塵、調校
儀器使用一定時(shí)間后，內部會(huì )積累一定量的塵埃，**由維修工程師或在工程師指導下定期開(kāi)啟儀器外罩對內部進(jìn)行除塵工作，同時(shí)將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固，對光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)行清潔，必要時(shí)對光路進(jìn)行校準，對機械部分進(jìn)行清潔和必要的潤滑，***后恢復原狀，再進(jìn)行一些必要的檢測、調校和記錄。

4.3.4 正確使用比色皿
拿比色皿時(shí)，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。清洗比色皿時(shí)，先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。若被比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1:2）浸泡片刻，再用水沖洗。每次做完實(shí)驗應立即洗凈比色皿。比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。測定有色溶液吸光度時(shí)，一定要用有色溶液洗比色皿內壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。在測定一系列溶液的吸光度時(shí)，通常都按由稀到濃的順序測定，以減少測量誤差。
若分光光度計噪音比較大，有可能是光源燈泡使用時(shí)間超過(guò)壽命期，可更換光源燈泡。
若自檢時(shí)提示波長(cháng)自檢出錯，有可能是自檢過(guò)程中打開(kāi)過(guò)儀器樣品室的蓋子，可關(guān)上儀器樣品室蓋子，重新自檢。