KinExA 4000

Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美國創(chuàng )立，產(chǎn)品基于的Kinetic Exclusion Assay（KinExA®）技術(shù)。Sapidyne這個(gè)名字來(lái)源于拉丁語(yǔ)“Sapid"，意味著(zhù)令人愉悅的想法，而“dyne"則是希臘語(yǔ)力量的意思。 所以Sapidyne意味著(zhù)一種在智力上令人愉悅的力量。

Kinetic Exclusion Assay（KinExA®）技術(shù)

一、平衡態(tài)檢測

在實(shí)驗過(guò)程中，一種結合分子濃度恒定（Constant Binding Partner,CBP)，另外一種濃度梯度分子（Titrant）與CBP混勻孵育；同時(shí)用Titrant包被磁珠。

A.濃度梯度Titrant與CBP                         B. 加入抗CBP的熒光抗體，               C. 清洗掉非特異熒光

混合物流過(guò)流路，游離的                           熒光信號隨抗體結合到                     信號，只剩與CBP特異

CBP被流路中磁珠上的                               CBP上而增加。                              結合的熒光抗體，測定

Titrant捕獲。                                                                                                特異性信號。

Titrant濃度梯度與游離CBP（即End Signal）                                      儀器記錄實(shí)時(shí)結合（A-C）曲線(xiàn)，并自動(dòng)

作圖—游離CBP與Titrant的量有關(guān)，Titrant                                        將熒光信號轉變?yōu)殡娦盘?；特異?

濃度越高游離CBP越少，信號越低；擬合                                           信號（End Signal）用于曲線(xiàn)擬合。

該曲線(xiàn)可獲得Kd與CBP活性濃度。

二、動(dòng)力學(xué)檢測

采用平衡態(tài)檢測中已包被Titrant的磁珠作為動(dòng)力學(xué)實(shí)驗的固定相捕獲劑。

KinExA 可以用于檢測： 數據可用于：

完整真核細胞 FDA審評

純化和未純化分子 新藥審批申請

解離慢的高親和力分子 申請

活性濃度 基金申請

親和力和動(dòng)力學(xué) 文章發(fā)表

三、KinExA的價(jià)值：新藥研發(fā)成本動(dòng)輒數十上百億美元，靈敏可靠的儀器在研發(fā)早期即可協(xié)助準確甄選苗頭候選藥物（hit），減少不必要的支出，降低研發(fā)風(fēng)險。由于KinExA可在生理條件下獲取準確可靠的結合常數，具有很高生物相關(guān)性，而且成本極低，目前被很多制藥公司用作主要的驗證工具。此外，KinExA的分析軟件可以輕松地解讀候選分子的結合特征，節省研究人員的時(shí)間，增加結果的可靠性。

四、與SPR的區別：“SPR在芯片表面固定一個(gè)分子，通過(guò)芯片表明與溶液間二維相互作用的物質(zhì)量改變而實(shí)現SPR檢測。這就帶來(lái)了非常顯著(zhù)的缺點(diǎn)：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質(zhì)量遷移影響動(dòng)力學(xué)分析（例如，流速會(huì )影響實(shí)驗結果）、被檢測分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結構其分子量有上限限制、樣品需要純化及無(wú)法檢測完整細胞。

相反，KinExA分析三維水平及游離狀態(tài)相互作用，不固定任何分子、不會(huì )對平衡帶來(lái)影響、沒(méi)有質(zhì)量遷移的限制、可以檢測未純化樣品和完整細胞；因此，極寬范圍內的生物分子、生物結構及完整細胞均可靈活分析。"

五、KinExA  vs. SPR：

1、與SPR的區別：SPR在芯片表面固定一個(gè)分子，通過(guò)芯片表明與溶液間二維相互作用的物質(zhì)量改變而實(shí)現SPR檢測。這就帶來(lái)了非常顯著(zhù)的缺點(diǎn)：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質(zhì)量遷移影響動(dòng)力學(xué)分析（例如，流速會(huì )影響實(shí)驗結果）、被檢測分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結構其分子量有上限限制、樣品需要純化及無(wú)法檢測完整細胞。

相反，KinExA分析三維水平及游離狀態(tài)相互作用，不固定任何分子、不會(huì )對平衡帶來(lái)影響、沒(méi)有質(zhì)量遷移的限制、可以檢測未純化樣品和完整細胞；因此，極寬范圍內的生物分子、生物結構及完整細胞均可靈活分析

2、與SPR技術(shù)的對比：為了表征治療性單克隆抗體候選分子，研究者采用不同類(lèi)型芯片，從Biacore系統獲得同一組單抗-抗原的53組數據，與KinExA實(shí)驗數據對比發(fā)現，親和力及動(dòng)力學(xué)數據與所使用的芯片類(lèi)型有關(guān)，帶負電荷的CM5,CM4及CM1芯片對Biacore的動(dòng)力學(xué)數據有不利的影響。為了驗證這一假設，作者通過(guò)Biacore液相實(shí)驗，KinExA平衡態(tài)滴定以及KinExA動(dòng)力學(xué)實(shí)驗，精確計算抗體與抗原的親和力及動(dòng)力學(xué)參數。結果表明隨著(zhù)芯片表面負電荷的降低，親和力及動(dòng)力學(xué)參數與液相實(shí)驗所得的結果越接近?？赡艿脑颍海?）帶負電荷的葡聚糖芯片與抗體之間的空間位阻影響抗原的結合；（2）帶負電荷的抗原與芯片表面的負電荷靜電排斥。

表中結果表明：對于Biacore技術(shù)，不同的固定方式（氨基偶聯(lián)，捕獲）以及不同的芯片，對實(shí)驗結果均有明顯影響。而采用KinExA技術(shù)，溶液中加葡聚糖，對結果也無(wú)明顯影響。

圖A,圖B均采用KinExA技術(shù)檢測。圖A中buffer不含葡聚糖，KD=24.7pM；圖B中buffer加入葡聚糖，KD=33.2pM。

圖C，圖D均采用Biacore技術(shù)檢測。圖C采用氨基偶聯(lián)的方式CM5芯片固定抗體，KD=2.05nM；圖D采用捕獲的方式CM5芯片固定抗體，KD=2.86nM

六、案例

案例一：完整細胞的相互作用檢測

<背景>：?jiǎn)慰寺】贵wXMetA是胰島素受體（IR）變構部分的激動(dòng)劑，其激活代謝Akt激酶信號通路，而對有絲分裂胞外信號調節激酶（ERK）信號通路幾乎沒(méi)有影響。為了研究這種選擇性信號通路的性質(zhì)，作者驗證了XMetA對CHO細胞中IR，Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。

<目的>：完整細胞親和力檢測。

<方法>：研究者將表達短鏈型（IR-A）及長(cháng)鏈型（IR-B）胰島素受體的不同濃度CHO細胞分別與XMetA孵育，通過(guò)離心獲得游離的XMetA，用KinExA儀器檢測親和力。另外，作者采取同樣的策略，用KinExA儀器檢測胰島素與CHO細胞表面IR-A，IR-B的親和力。

<結論>：XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM，與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外，在對照抗體組，胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM；在XMetA組，胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM；在對照抗體組，胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM；在XMetA組，胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數據同時(shí)說(shuō)明， XMetA與IR亞型的結合與胰島素無(wú)關(guān)。

圖A，圖B通過(guò)KinExA技術(shù)檢測胰島素對XMetA與表達IR-A，IR-B的CHO細胞結合的影響；

圖C，圖D通過(guò)KinExA技術(shù)檢測XMetA對胰島素與表達IR-A，IR-B的CHO細胞結合的影響。

案例二：細胞與上清未純化樣品檢測

<背景>：?jiǎn)慰寺】贵w（mAb）在體內與膜蛋白間親和力的可靠評估是的主要問(wèn)題。在BV展示系統中，膜蛋白能以天然狀態(tài)在病毒表面展示。

<目的>：細胞與上清中未純化樣品親和力檢測。

<方法>：研究者基于KinExA技術(shù)，結合桿狀病毒（BV）膜蛋白展示系統，描述了一個(gè)簡(jiǎn)單而高度敏感的單克隆抗體評估方法。

<結論>：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)與全細胞分析方法一致（R2=0.998），表明基于KinExA技術(shù)檢測方法提供了針對細胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準確的評估。

上圖中顯示的是KinExA實(shí)驗中所使用的抗原。A圖中可溶性Robo1用于標準的實(shí)驗分析；B圖中表達天然活性Robo1的CHO細胞用4%多聚甲醛固定，用于細胞分析實(shí)驗；C圖中表達天然活性Robo1的BV磁珠用于BV展示分析

下圖采用KinExA技術(shù)檢測抗Robo1抗體與抗原的親和力。曲線(xiàn)上方的數字代表抗體的活性濃度。

七、儀器型號

1、KinExA 4000可以檢測細胞（天然的和工程化的）、非純化樣品、血清樣品，小分子等的相互作用和親和力。 四個(gè)顆粒儲存器可容納四種不同的固相劑，并可與多達270個(gè)樣品一起支持長(cháng)時(shí)間的無(wú)人值守操作。 與其他生物傳感器不同，KinExA能夠測量生理相關(guān)條件下的相互作用。

2、KinExA 3100 / 3200 也是基于動(dòng)態(tài)排阻分析技術(shù)開(kāi)發(fā)的一種特殊性平臺。儀器超高的靈敏性來(lái)源于其具有技術(shù)的流路，高質(zhì)量的管路及超敏的光學(xué)系統。通過(guò)KinExA儀器能獲得精確，靈敏，可靠的數據。

3、自動(dòng)進(jìn)樣器使用靈活，可無(wú)人置守長(cháng)時(shí)間操作多個(gè)實(shí)驗，為KinExA儀器使用者提高工作效率。顆粒儲存器能容納四種不同的固相劑，可支持多達270個(gè)樣品的自動(dòng)操作。KinExA Pro軟件用于實(shí)驗程序的設計，可以設置開(kāi)始檢測時(shí)間以及孵育時(shí)間。

八、KinExA參考文獻

1、2018年日本東京大學(xué)高級科學(xué)技術(shù)研究中心定量生物學(xué)和醫學(xué)系Osamu Kusano-Arai等老師利用KinExA 3200 (Sapidyne Instruments Inc.)在《單克隆抗體在免疫診斷和中的應用(Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy)》上發(fā)表《對一種抗體可以識別CDH17上不同表位的免疫毒素混合物的胃癌細胞的協(xié)同細胞毒性影響》，該研究結果表明，以多種表位為靶點(diǎn)的免疫毒素復合物對低表達水平細胞具有協(xié)同作用，擴大了腫瘤免疫毒素治療的適用范圍。

2、2018年Eric S. Furfine博士等人利用KinExA 儀器 (Sapidyne Instruments Inc.)在《Eye & Contact Lens》上發(fā)表《EBI-005的臨床前開(kāi)發(fā):一種IL-1受體-1抑制劑，用于眼表炎性疾病的局部治療》，該研究對小鼠和兔的受體親和力、藥物生物利用度、免疫原性反應、安全性和耐受性進(jìn)行了評估。

3、2017年Jonathan K. Fleming和Jonathan M. Wojciak利用KinExA 3200 (Sapidyne Instruments Inc.)在《分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)》上發(fā)表《測定1-磷酸鞘氨醇：動(dòng)力學(xué)排斥試驗的蛋白質(zhì)相互作用》，由于缺乏固有的可追溯特性(如熒光或UV/Vis吸收)，確定與溶磷脂結合的蛋白(如S1P)的準確、可靠的平衡解離常數的能力具有挑戰性。通過(guò)共價(jià)鍵或衍生化修飾S1P可能改變蛋白質(zhì)識別[1]的溶解性和/或自然模式。此外，由于S1P在水介質(zhì)中表現出較差的溶解度特性，依賴(lài)于游離和結合S1P物種的物理分離的結合研究可能是困難的。然而，為了支持蛋白質(zhì)的結構和功能，水介質(zhì)是必需的。該文章中描述的KinExA方法克服了上面研究蛋白質(zhì)-脂類(lèi)相互作用的問(wèn)題，并闡明了使用載體蛋白遞送溶磷脂的效果。

4、2017年清華大學(xué)醫學(xué)院基礎醫學(xué)部Hanqiu Zheng等老師利用KinExA 技術(shù)在《CellPress》上發(fā)表《治療抗體靶向腫瘤和生態(tài)位衍生Jagged1使骨轉移對敏感》，作者報道了針對Jagged1(克隆15D11)的高效單克隆抗體的發(fā)展。15D11除了對Jagged1表達的腫瘤細胞骨轉移的抑制作用外，對的骨轉移也有明顯的敏感性，誘導成骨細胞中Jagged1的表達，為癌細胞提供生存空間。使用了成骨細胞特異性的Jagged1轉基因小鼠模型，作者進(jìn)一步證實(shí)了骨母細胞Jagged1的骨轉移功能。這些發(fā)現確立了15D11作為預防或治療骨轉移的潛在治療藥劑。

5、2007年清華大學(xué)化學(xué)工程系Feng-yi Su等老師利用KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc.)在《生物傳感器與生物電子學(xué)(Biosensors and Bioelectronics)》上發(fā)表《基于流式動(dòng)力學(xué)排斥熒光免疫分析，簡(jiǎn)單靈敏的細菌定量》，證明KinExA是細菌測定的可靠和有希望的替代方法。然而，與其他免疫測定方法一樣，這種方法的可達到的檢出限受到抗體與抗原的親和性的限制。通過(guò)增加抗體對目標細菌的特異性，使用KinExA可以提高檢測靈敏度，并且幾乎沒(méi)有交叉反應性的抗體在復雜群落中的細菌測定的應用中是潛在候選者。

KinExA部分參考文獻

親和力和動(dòng)力學(xué)檢測:

KinExA技術(shù)概述:

l Wani T.A., et al. 2016. New analytical application of antibody-based biosensor in estimation of thyroid-stimulating hormone in serum. Bioanalysis 10.4155/bio-2015-0034.

l Glass T.R., Winzor D.J. 2014. Conformation of the validity of the current characterization of immunochemical reactions by kinetic exclusion assay. Anal Biochem 456: 38-42. Bee C., et al. 2012. Exploring the dynamic range of the kinetic exclusion assay in characterizing antigen-antibody interactions. PLOS ONE 7(4): e36261.

l Darling R.J. and Brault P.A. 2004. Kinetic exclusion assay technology: characterization of molecular interactions. Assay and Drug Dev Tech 2(6): 647-657.

KinExA在藥物研發(fā)中的作用:

l Danial M, et al. 2017.Site-Specific Polymer Attachment to HR2 Peptide Fusion Inhibitors against HIV-1 Decreases Binding Association Rates and Dissociation Rates Rather Than Binding Affinity. Bioconjug Chem. 10.1021/acs.bioconjchem.6b00540.

l Kariolis MS, et al. 2017. Inhibition of the GAS6/AXL pathway augments the efficacy of chemotherapies. J Clin Invest. 10.1172/JCI85610.

l Fan Y., et al. 2016. Immunological Characterization and Neutralizing Ability of Monoclonal Antibodies Directed Against Botulinum Neurotoxin Type H. The Journal of Infectious Diseases 15;213(10):1606-14.

l K?ck, K., et al. 2015. Preclinical development of AMG 139, a human antibody specifically targeting IL-23. British Journal of Pharmacology 172:159-172.

l Tabrizi M.A., et al. 2009. Translational strategies for development of monoclonal antibodies from discovery to the clinic. Drug Discov Today 14(5/6): 298-305.

液相中檢測非純化樣品:

l Tigue NJ, et al. 2017. MEDI1873, a potent, stabilized hexameric agonist of human GITR with regulatory T-cell targeting potential. Oncoimmunology.10.1080/2162402X.2017.1280645.

l Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem. 10.1016/j.ab.2016.04.004.

l Blake R.C., Li X., Blake D.A. 2007. Covalent and noncovalent modifications induce allosteric binding behavior in a monoclonal antibody. Biochemistry 46: 1573-1586.

與SPR比較:

l Fleming JK, Wojciak JM. 2017. Measuring Sphingosine-1-Phosphate: Protein Interactions with the Kinetic Exclusion Assay. Methods Mol Biol. 10.1007/7651_2017_5.

l Abdiche YN. et al. 2016. Assessing kinetic and epitopic diversity across orthogonal monoclonal antibody generation platforms. MAbs. 10.1080/.2015.1118596.

l Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem. 10.1016/j.ab.2016.04.004.

l Drake A.W., et al. 2012. Biacore surface matrix effects on the binding kinetics and affinity of an antigen/antibody complex. Anal Biochem. 429(1):58-69.

高親和力檢測:

l Abdiche YN. et al. 2016. Assessing kinetic and epitopic diversity across orthogonal monoclonal antibody generation platforms. MAbs. 10.1080/.2015.1118596.

l Owyang A.M., et al. 2011. XOMA 052, a potent, high-affinity monoclonal antibody for the treatment of IL-1B-mediated diseases. mAbs 3(1): 49-60.

l Champagne K., Shishido A., Root M.J. 2009. Interaction of HIV-1 inhibitory peptide T20 with gp41 N-HR coiled coil. J Biol Chem 284: 3619-3627.

l Kostenuik P.J., et al. 2009. Denosumab, a fully human monoclonal antibody to RANKL, inhibits bone resorption and increases BMD in knock-in mice that express chimeric (murine/human) RANKL J Bone Miner Res 24: 182-195.

l Luginbuhl B., et al. 2006. Directed evolution of an anti-prion protein scFv fragment to an affinity of 1 pM and its structural interpretation. J Mol Biol 363: 75-97.

l Rathanaswami P., et al. 2005. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Comm 334: 1004-1013.

逆向檢測:

l Razai A., et al. 2005. Molecular evolution of antibody affinity for sensitive detection of botulinum neurotoxin type A. J Mol Biol 351: 158-169.

完整細胞檢測:

l Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

l Rathanaswami P., Babcook J., Gallo M. 2008. High-affinity binding measurements of antibodies to cell-surface-expressed antigens. Anal Biochem 373: 52-60.

l Xie L., et al. 2005. Measurement of the functional affinity constant of a monoclonal antibody for cell surface receptors using kinetic exclusion fluorescence immunoassay. J Immunol Methods 304: 1-14.

未純化抗原檢測:

l Wani T.A., et al. 2016. Analytical Application of Flow Immunosensor in Detection of Thyroxine and Triiodothyronine in Serum. Assay Drug Dev Technol.14(9):535-542.

l Bee C., et al. 2013. Determining the binding affinity of therapeutic monoclonal antibodies towards their native unpurified antigens in human serum. PLOS ONE 8(11): e80501.

l Fujino, Y., et al. 2012. Robust in vitro affinity maturation strategy based on interface-focuses high-throughput mutational scanning. Biochem Biophys Res Commun 4283:395-400.

l Rathanaswami P., et al. 2011. Kinetic analysis of unpurified native antigens available in very low quantities and concentrations. Anal Biochem 414: 7-13.

其他類(lèi)型研究:

l Li X., Kaattari S.L., Vogelbein M.A., Vadas G.G., Unger M.A., 2016. A highly sensitive monoclonal antibody based biosensor for quantifying 3-5 ring polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in aqueous environmental samples. Sens Biosensing Res. 7:115-120.

l Lou J., et al. 2010. Affinity maturation of human botulinum neurotoxin antibodies by light chain shuffling via yeast mating. Protein Eng Des Sel 23(4): 311-319.

l Kahle K.M., Steger H.K., Root M.J. 2009. Asymmetric deactivation of HIV-1 gp41 following fusion inhibitor binding. PLOS Path 5(11): 1-11.

l Nowakowski A., et al. 2002. Potent neutralization of botulinum neurotoxin by recombinant oligoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci 99: 11346-11350.

免疫檢測技術(shù):

l Darwish I.A., et al. 2013. Kinetic-exclusion analysis-based immunosensors versus enzyme-linked immunosorbent assays for measurement of cancer markers in biological specimens. Talanta 111: 13-19.

l Prieto-Simon B., Miyachi H., Karube I., Saiki H. 2010. High-sensitive flow-based kinetic exclusion assay for okadaic acid assessment in shellfish samples. Biosens Bioelectron 25: 1395-1401.

l Sasaki K., Oguma S., Namiki Y., Ohmura N. 2009. Monoclonal antibody to trivalent chromium chelate complex and its application to measurement of the total chromium concentration. Anal Chem 81: 4005-4009.

l Glass T.R., Ohmura N., Saiki H. 2007. Least detectable concentration and dynamic range of three immunoassay systems using the same antibody. Anal Chem 79: 1954-1960.

l Bromage E.S., et al. 2007. The development of a real-time biosensor for the detection of trace levels of trinitrotoluene () in aquatic environments. Biosens Bioelectron 22: 2532-2538.

l Sasaki K., Glass T.R., Ohmura N. 2005. Validation of accuracy of enzyme-linked immunosorbent assay in hybridoma screening and proposal of an improved screening method. Anal Chem 77: 1933-1939.

l Glass T.R., et al. 2004. Use of excess solid-phase capacity in immunoassays: advantages for semicontinuous, near-real-time measurements and for analysis of matrix effects. Anal Chem 76: 767-772.

l Ohmura N., Lackie S., Saiki H. 2001. An immunoassay for small analytes with theoretical detection limits. Anal Chem 73: 3392-3399.

九、KinExA部分工業(yè)客戶(hù)