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更新時(shí)間：2025-01-06 21:17:06瀏覽次數：33次
聯(lián)系我時(shí)，請告知來(lái)自 紡織服裝機械網(wǎng)（貨號：WLRE8208KIT）原理概述：本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈，反應體系中的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴增反應
（貨號：WLRE8208KIT）
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈，反應體系中的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進(jìn)行快速核酸擴增反應。本試劑盒在42 oC下，依賴(lài)核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備能實(shí)現對目標片段擴增過(guò)程的實(shí)時(shí)監控。適用于實(shí)驗室級別的RNA擴增以及其他檢測用途的RNA擴增使用。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時(shí)間短（僅需20 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應組分為干粉狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，易于保存。
可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀，恒溫熒光擴增儀器等熒光檢測設備。
引物設計：
建議使用長(cháng)度在 30-35 bp的引物，引物過(guò)短會(huì )影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長(cháng)度建議在150-300 bp。
熒光探針設計：
探針序列不與特異性引物識別位點(diǎn)重疊，長(cháng)度為46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四個(gè)修飾位點(diǎn)：距離5’端的≥35 nt的中部位置標記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標記一個(gè)熒光基團，下游標記一個(gè)粹滅基團，兩個(gè)基團的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標記一個(gè)修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。
試劑盒組成：
| 組成 | 含量 |
| A buffer | 1.6 mL×1管 |
| B buffer | 150 μL×1管 |
| 試劑 | 48份 |
| 使用說(shuō)明書(shū) | 1份 |
試劑盒儲存：
運輸條件：低溫運輸；
儲存條件：建議儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓和反復凍融；
產(chǎn)品有效期：14個(gè)月。
操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
1) 每個(gè)干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會(huì )對實(shí)驗效果產(chǎn)生影響）；
2) 每個(gè)反應管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個(gè)反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；
3) 向反應管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為13.5 μL）；
4) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務(wù)必上下顛倒甩動(dòng)反應管8-10次進(jìn)行混勻；對于多個(gè)反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側上下顛倒后混勻）；
5) 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。熒光檢測程序設置為：恒溫42 oC；每30 s采集一次FAM通道（信號采集通道的選擇與熒光探針設計一致）熒光值；反應時(shí)間20 mins。
注：如使用ABI系列PCR儀，請務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none"。
體系配制
| 組分 | 體積（μL） |
| A buffer | 29.4 |
| 上游引物(10 μM) | 2 |
| 下游引物(10 μM) | 2 |
| 探針(10 μM) | 0.6 |
| ddH2O和RNA模板 | 13.5 |
| B buffer | 2.5 |
| 總體積 | 50 |
注意事項：
1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應時(shí)請注意避免核酸污染，并設置空白對照；
2． 使用時(shí)請取出實(shí)驗所需的MIRA反應單元的數量，剩余部分請置于存儲條件下。
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