北京立博泰業(yè)科技有限公司
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更新時(shí)間：2025-01-06 21:21:27瀏覽次數：28次
聯(lián)系我時(shí)，請告知來(lái)自 紡織服裝機械網(wǎng)（貨號：WLE5003）原理概述：本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板
（貨號：WLE5003）
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區域，并開(kāi)始對DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結合到引物的3’末端，開(kāi)始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下，依賴(lài)核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備能實(shí)現對目標片段擴增過(guò)程的實(shí)時(shí)監控。
引物設計：
建議使用長(cháng)度在30-35 bp的引物，引物過(guò)短會(huì )影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長(cháng)度建議在150-300 bp，通常不超過(guò)500 bp。
熒光探針設計：
探針序列不與特異性引物識別位點(diǎn)重疊，長(cháng)度為46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四個(gè)修飾位點(diǎn)：距離5’端的≥35 nt的中部位置標記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標記一個(gè)熒光基團，下游標記一個(gè)粹滅基團，兩個(gè)基團的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標記一個(gè)修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。
試劑盒組成：
100T/盒
| 組成 | 含量 |
| C buffer | 1 mL×2管 |
| L buffer | 500 μL×1管 |
| P-core | 1.2 mL×1管 |
| E-core | 60 μL×1管 |
| B buffer | 300 μL×1管 |
| 使用說(shuō)明書(shū) | 1份 |
試劑盒儲存：
運輸條件：低溫運輸；
儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；
操作步驟：提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。
1) 向無(wú)菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；
2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；
3) 向反應管中加入12 μL P-core和0.6 μL E-core，（步驟1~3可以混合后再分裝至反應管中）；
4) 向反應管中加入3.8 μL核酸模板；
5) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（加入B buffer反應立即被啟動(dòng)）；混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。熒光檢測程序設置為：恒溫39 oC；每30 s采集一次熒光信號；反應時(shí)間20 mins。
注：如使用ABI系列PCR儀，請務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none"。
體系配制
| 組分 | 體積（μL） |
| C buffer | 20
5 |
| L buffer | |
| P-core | 12 |
| E-core | 0.6 |
| dNTPs(10 mM) | 1.5 |
| 下游引物(10 μM) | 2 |
| 下游引物(10 μM) | 2 |
| 探針(10 μM) | 0.6 |
| DNA模板 | 3.8 |
| B buffer | 2.5 |
| 總體積 | 50 |
| N：陰性對照； P：正對照 |
注意事項：
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